الکتروفورز
الکتروفورز تشکیل شده از دو کلمه Electro به معنای الـکتریکی و Phoresis به معنای حرکت و انتـقال ذره تـشـکیل شـده است و ساخت و نصب سکوبندی ازمایشگاهی در کل به معنی حرکت ذرات در یک مایع تحت تاثیر میدان الکتریکی است که از شناخته شده ترین روش های آزمایشگاهی برای جداسازی بیومولکول ها به حساب می آید. به عنوان مثال می توان به وسیله روش الکتروفورز پروتئین های باردار و یا DNA را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی در میدان الکتریکی بوسیله منبع تغذیه الکتروفورز تفکیک کرد.
اجزای دستگاه الکتروفورز
- محفظه
- منبع تغذیه الکتریکی
- محیط پشتیبان
- معرف شیمیایی
- گرمکن (انکوباتور)
- غلظت سنج
- آند (الکترود مثبت) و کاتد (الکترود منفی) که از جنس گرافیت یا پلاتین هستند.
کاربردهای الکتروفورز
- تعیین نقشه پپتیدی
- تعیین جرم مولکولی نسبی
- مشخص کردن غلظت پروتئین
- شناسایی تغییرات پروتئین و DNA
عواملی که بر سرعت حرکت ترکیبات در روش الکتروفورز تاثیر می گذارند
- اندازه و شکل یون
- بار الکتریکی خالص یون
- شدت میدان الکتریکی
- دمای محیط الکتروفورزی
DNA Ladder
DNA Ladder ، شامل طیف وسیعی از مارکرهای مولکولی است که به اندازه‌گیری سایز های مختلف DNA می پردازد.
همزمان با پیشرفت تکنیـک هـای ژنتیـک مولکـولی (Molecular genetic) و دستکاری ژنتیک و نیز روش های تشخیصی برای بررسی اولیه قطعات حاصل از هـضم آنزیمـی، واکـنش زنجیـرهای پلیمـراز، بررسی وکتورهای حاوی DNA مورد نظـر و سـایر روش هـای مـورد اسـتفاده در ژنتیـک مولکـولی و بیوتکنولـوژی، بـه DNA مارکرهـای استانداردی نیاز می باشد تا از طریـق مقایـسه میـزان حرکـت قطعـات شناخته شده آن طـی ژل الکتروفـورز بتـوان انـدازه قطعـات مجهـول حاصـل از آزمـایش را برحسب جفـت بـاز تخمـین زد. مارکرهـای استاندارد می توانند حاوی قطعاتی از DNA با اندازه هایی متنوع از چند جفت باز تا چند کیلوباز باشند.
یکی از ساده ترین راه های تهیـه DNA مارکر استفاده از الگوی هضم آنزیمی انواع فاژ یا پلاسمیدهایی استکه نقـشه محل هـای بـرش آن هـا توسـط آنـزیم هـای انـدونوکلئاز محدودکننده مشخص می باشد. قطعات حاصل توسـط ایـن روش بـه نوع آنزیم های اندونوکلئاز، ترکیب بازی ژنوم و شرایط هضم آنزیمـی بستگی دارد. معمـولا بـه مارکرهـای نوکلئیـک اسیدی تولید شده با این شیوه، مارکر DNA گفته می شود.
این روش با وجود سادگی دارای کاستی هایی نیز می باشد، از قبیل فقـدان الگـویی منظم برای افزایش طول قطعات، متغیر بودن غلظت هر قطعه به خـاطر تفاوت در وزن مولکولی نسبی آن ها و نیز پیچیده بودن اندازه قطعـات به دلیل اتفاقی بودن محل های بـرش آنزیمـی بـه نحـوی کـه بـه خـاطرسپاری طول و در نتیجه استفاده از آنها را با مشکل همراه مـی سـازد.
بنابراین برای افزایش دقت در تعیین اندازه و سـادگی اسـتفاده وجـود باندهای فراوان با محدوده اندازه هایی منطقی و پرکاربرد که به صورت منظم و مساوی افزایش می یابند، بسیار سودمند خواهد بـود.
بانـدهای استاندارد باید این قابلیت را داشته باشـند کـه بـا وضـوح برابـر قابـل تشخیص باشند، به این نوع از مارکرهـای نوکلئیـک اسـیدی معمـولا Ladder DNA گفته می شـود کـه طراحـی و سـاخت آن ها توسـط شرکت های تولیدکننده محصولات بیوتکنولـوژی بـه صـورت صـنعتی انجـام می گیـرد. تولیـد Ladder هـای DNA بـا ایـن خـصوصیات بـا شیوه های مختلفی امکانپذیر اسـت، کـه از انـواع آن هـا مـی تـوان بـه استفاده از روش های مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) اشـاره نمود. قطعات حاصل از این راه قابل طراحی در انـدازه هـای مطلـوب می باشند.
اما مشکل اصلی این روش پیچیدگی و هزینـه بـر بـودن آن به واسطه استفاده از چندین مجموعه پرایمر است که هر یک بـه نوبـه خود نیازمند برنامه دهی منحصر بـه فـردی بـه ماشـین PCR بـوده و از طرفی هزینه ساخت تعداد زیادی پرایمـر بـه لحـاظ اقتـصادی مقـرون به صرفه نمی باشد.
زمان الکتروفورز از عواملی مانند اندازه، اختلاف جرمی که مولکول ها با هم دارند و مقدار ولتاژ تاثیر می پذیرد. به عنوان مثال اگر طول زمان الکتروفورز زیاد باشد، امکان این که مولکول ها از ژل خارج شوند وجود دارد و برعکس اگر طول این زمان کوتاه باشد، احتمالا باند ها روی هم می افتند و هم چنین اسمیرها غیر قابل تمایز می شوند.
مارکر های وزنی که به مارکر Ladder معروف هستند همگام با ران شدن نمونه ها به منظور تشخیص وزن مولکول های جدا شده ران می گردند. Ladder بر اساس جمعیت مولکولی که قرار است جدا شوند انتخاب می شوند . Ladder حاوی مارکرهای دارای وزن کمتر و نیز وزن بیشتر از مولکولی که قرار است تفکیک شود باشد.
معمولا یکی از چاهک های الکتروفورز به نمونه Ladder اختصاص داده می شود که از ترکیباتی همانند جنس نمونه مورد آزمایش تشکیل شده است.. با شروع شدن عمل الکتروفورز تعدادی باند در چاهک Ladder به وجود خواهد آمد که از مطابقت دادن نمونه مجهول با باند می توان وزن تقریبی نمونه مجهول را بدست اورد.
باند ژل الکتروفورز
هر جرم مولکولی خاص نشان دهنده یک مولکول DNA خاص است که با باند هایی نشان داده می شوند. باندهایی که در سمت راست و چپ این تصویر مشاهده می شوند، نشانگر ladder هستند.
- پنجشنبه ۰۳ اسفند ۰۲ ۱۱:۲۴
- ۱۱ بازديد
- ۰ ۰
- ۰ نظر